Американские ученые разработали метод секвенирования РНК с длинными прочтениями, который оказался на 2-3 порядка дешевле стандартных способов. Это поможет улучшить понимание, диагностику и лечение сложных заболеваний, таких как рак. Исследование опубликовано в журнале Nature Communications.
Для синтеза белков в клетке сначала нужно получить молекулу РНК, которая служит матрицей. РНК считывается с генов и перед синтезом белка может быть разрезана разными способами в ходе альтернативного сплайсинга. Этот процесс позволяет сделать так, чтобы один ген мог кодировать несколько разных белков. Однако при разных болезнях, например при раке, альтернативный сплайсинг может быть нарушен, из-за чего появляются вредные молекулы РНК. Чтобы лучше понять этот процесс, ученые стараются учесть все молекулы РНК, которые могут образоваться с одного гена. Для этого они используют метод секвенирования РНК с длинными прочтениями, который позволяет расшифровать длинные молекулы — вплоть до 10 тысяч оснований длиной. Тем не менее текущие методы очень дорогие и недостаточно эффективные. Есть также целевое секвенирование, при котором улучшается прочтение нужных участков. При нем можно использовать специальные зонды захвата из олигонуклеотидов (короткие цепочки нуклеиновых кислот), к которым прикреплены молекулы биотина. Зонды подбираются таким образом, чтобы они были комплементарны участкам в целевом регионе и могли связаться с ними, таким образом позволяя выделить только нужные нуклеиновые кислоты из образца. Хотя такой подход повышает эффективность секвенирования, коммерчески доступные зонды довольно дорогие и могут быть использованы только для проведения ограниченного числа реакций.
Американские ученые разработали метод TEQUILA-seq, который позволяет синтезировать зонды захвата с биотином из небольшого количества олигонуклеотидов без биотина. Сам метод основан на реакции изотермической амплификации, которая запускается под действием специально фермента — эндонуклеазы — и включает в себе замещение цепи. Это значит, что реакция запускается из-за того, что фермент делает надрез в одной цепочке олигонуклеотида, после чего запускается процесс его копирования, и количество этого олигонуклеотида значительно увеличивается. При этом реакция проводится при постоянной температуре. Ученые показали, что при использовании в качестве матрицы всего 2 нг олигонуклеотидов можно получить 25 мкг зондов для секвенирования. Они, в свою очередь, могут быть использованы для проведения 250 реакций захвата. Такой подход удешевляет TEQUILA-seq на 2-3 порядка по сравнению с другими способами секвенирования РНК.
Чтобы оценить эффективность метода, ученые провели секвенирование синтетических РНК и человеческих РНК, полученных с нескольких генов. Зонды TEQUILA оказались так же эффективны, как и коммерчески доступные, но более дорогие аналоги. Чтобы показать, насколько метод может быть полезен в биомедицинской сфере, ученые просеквенировали с помощью TEQUILA-seq молекулы РНК с 468 генов для 40 клеточных линий рака молочной железы. Они смогли обнаружить ранее неизвестные молекулы РНК, что может улучшить понимание рака.
Ученые отметили, что TEQUILA-seq может применяться для секвенирования не только РНК, но и ДНК. При этом можно делать как длинные, так и короткие прочтения. Таким образом, метод оказался не только более дешевым и удобным, но и универсальным.
Подписывайтесь на InScience.News в социальных сетях: ВКонтакте, Telegram, Одноклассники.
